プロミックス™(Promix™)ペプチド／タンパク質用イオン交換体／逆相ミックス・クロマトグラフィ

シルク・テクノジー(SIELC Technologies)社が開発したプロミックス(Promix)カラムは、多孔性球形シリカゲルを基材として、(−)の電荷を持ち合わせたアルキル基を導入した、ペプチド／タンパク質用のカラムです。この強陽イオン交換体／逆相ミックス・クロマトグラフィモードは、ペプチド／タンパク質のバリアント(variants: アミノ酸一個の相違しかないような類縁物質)の分析／分取や、プロテオミクス分析などに最適です。

• 二次元クロマトグラフィ(強陽イオン交換体／逆相クロマトグラフィ)が一本のカラムで可能
• アミノ酸一個だけの違いのペプチド／タンパク質を分離
• ペプチド／タンパク質のバリアント分析における選択性向上
• 逆相／イオン交換体クロマトグラフィと比較して、高い吸着量
• ぎ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムを使用することで、高いMS感度
• 分析から分取までスケールアップが可能
• バッファー濃度や有機溶媒濃度の独立したコントロールにより、保持時間及び選択性のコントロールが、無制限に可能

図2. Isocratic Separation of Synthetic Peptide and Impurity

図3. Small Peptides Test Mixture (5 Angiotensins)

1. ARG-VAL-TYR-VAL-HIS-PRO-ILE 2. ARG-VAL-TYR-VAL-HIS-PRO-PHE 3. ALA-PRO-GLY-ASP-ARG-ILE-TYR-VAL-HIS-PRO-PHE 4. ASP-ARG-VAL-TYR-VAL-HIS-PRO-PHE-HIS LEU 5. ASP-ARG-VAL-TYR-ILE-HIS-PRO-PHE-HIS-LEU

Column: Promix™ MP, 4.6 x 250 mm 300 Å Mobile phase A: 0.4% TFA in 15% ACN Mobile phase B: 0.05% TFA in 35% ACN Gradient: 0-100% B in 15min Column: Promix™ MP, 4.6 x 150 mm 300 Å Mobile phase A: 0.4% TFA in Water Mobile phase B: 0.05% TFA in 40% ACN Gradient: 0-100% B in 30min

図4. Large Peptides Mixture

1. Ribonuclease A (mw 13,500)
2. Insulin (mw 5,700)
3. Lysozyme (mw 14,300)
4. B-Lactalbumin (mw 14,200)
5. Carbonic Anhydrase (mw 29,000)

逆相クロマトグラフィ・カラムでは分離が難しい、アミノ酸一個、二個の相違しかない天然型インスリンと、そのアナログである遺伝子組み換えの「ヒューマログ(Humalog): イーライリリー社」及び「ランタス(Lantus): アベンティス ファーマ社」も、イオン交換体／逆相ミックス・クロマトグラフィのプロミックスMPカラムですと容易に分離することができます(図5.参照)。

図5. Separation of Insulin Analogs

	Normal human insulin
	Synthetic insulin Humalog
	Sythetic insulin Lantus

図6. Separation Study of Synthetic Insulin Analogs (Lantus and Humalog)

Similarly to a traditional ion separation, the buffer concentration plays an important role in the mixed-mode technology altering the degree of ionic interaction of the biomolecules with the stationary phase. The amount of the organic modifier is also important in changing the degree of hydrophobic interaction. Independent adjustment of the amount of buffer and organic modifier creates infinite number of separation conditions that are suitable for many types of biomolecules. Generally three types of gradient separation mode available on Promix columns. Gradient of MeCN with isocratic buffer concentration, gradient of buffer concentration with isocratic MeCN concentration, and dual gradient of both MeCN and buffer.

低分子量のペプチドと高分子量のタンパク質が混合されたサンプルは、二種類のプロミックスHPLCカラムで分離できました。これはプロミックスMPカラムでは、保持が弱くて最初の1.5分間までに溶出した分画を、プロミックスSPカラムで再分離しました(図7.参照)。

図7. Separation of a Complex Mixture

複雑な混合サンプルなどの分析には、マルチ・グラジエントも使用可能です。

• 有機溶媒グラジエント
• イオン強度グラジエント
• 両方のマルチ・グラジエント
  (図8.参照)

図8. Albumin Digest Selectivity Affected by Buffer Concentration

プロミックスカラムの選択方法(図9.参照)

1. この表から対象となるペプチド／タンパク質の分子量と等電点(pI)によって、最適なプロミックスHPLCカラムを選択する。
2. 混合サンプルの複雑性によって、カラムの長さを選択する。

• タンパク質消化物、複雑な混合サンプル、プロテオーム分析には150〜250mm
• 合成ペプチドの分析／精製には50〜150mm

3. サンプル負荷量及び要求される感度などによって、カラム内径を選択する。
4. 移動相はpH 2〜4で、次のどれかを含有：

• TFA(0.05〜0.3%)
• ぎ酸(0.1〜0.9%)
• 酢酸アンモニウムか、ぎ酸アンモニウム

5. 有機溶媒はアセトニトリル
6. 最適な分離条件のために、イオン強度、pH、有機溶媒濃度などのグラジエントを調整する。
7. 各種プロミックスHPLCカラムの孔径：

• プロミックスSPカラム−100Å
• プロミックスAPカラム−100Å、300Å
• プロミックスMPカラム−300Å、800Å
• プロミックスLPカラム−800Å、ノンポーラス(無孔)

図9. Promix Column Selection Chart